T. V. F. Martins¹, A. P. Martino1, M. M. C. Granja1, R. S. Meireles1, D. L. Santos1 and J. L. Santos1

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¹MICROVET - Microbiologia Veterinária Especial,Viçosa, Minas Gerais - BR. 

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Introdução

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A mastite é uma das principais doenças que acometem rebanhos leiteiros bovinos no mundo, causando prejuízos econômicos graves tanto ao produtor quanto à indústria de laticínios (Ruegg, 2017). No Brasil, a perda anual causada pela mastite subclínica é estimada em até 1,75 bilhão de litros, cerca de 5% da produção total de leite do País (Santos et al., 2019). 

Mais de 80 diferentes microrganismos foram identificados como agentes causadores de mastite bovina. Dentre essas bactérias, são frequentemente isoladas Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis e Staphylococcus aureus. 

Espectrometria de massas vêm ganhando destaque para a identificação de espécies bacterianas. A grande variação na expressão de enzimas metabólicas, proteínas envolvidas na adesão e/ou invasão celular e variações na expressão das proteínas ribossômicas, alvo de detecção pelo MALDI-TOF MS, garantem adaptabilidade dos agentes. Desta forma, o emprego desta ferramenta auxilia na identificação da variabilidade que podem ser interpretadas para decisões de intervenção (Lartigue et al., 2009).

Dada a importância destes patógenos na cadeia produtiva leiteira foi proposto o estudo da diversidade proteica dos isolados de maior prevalência nas mastites bovinas. Portanto, o objetivo deste estudo foi realizar a análise da diversidade de proteínas em S. aureus, S. agalactiae e S. uberis, a partir de amostras de três estados brasileiros: Minas Gerais (MG), Espírito Santo (ES) e Paraná (PR).

 

Material e métodos

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S. agalactiae, S. uberis e S. aureus foram isolados no laboratório de Diagnóstico da MicroVet, a partir de amostras de leite provenientes de MG, ES e PR. Os isolados foram submetidos à análise por espectrometria de massas MALDI-TOF (Microflex) para identificação do perfil protéico. Três colônias isoladas foram capturadas e adicionadas aos poços da placa do equipamento. Na colônia foi adicionado 1 μL de ácido fórmico a 70%, seguido da 1 μL de matriz HCCA. Os espectros foram capturados e comparados com picos de referência (MSP) da biblioteca integrada do In Vitro Diagnostic (IVD). Os dendrogramas dos perfis foram construídos com o programa estatístico Matlab 7.1 integrado ao programa MALDI Biotyper 3.1, com os parâmetros: medida de distância por correlação e ligação por média, normalizada entre a distância 0 (concordância total) e 1000 (sem concordância). A medida de distância foi definida em correlação e o link foi definido em média.

 

Resultados e discussão

Os resultados das análises espectrais de cada um dos isolados avaliados estão presentes na figura 1. Para os isolados de S. aureus podemos observar a formação de dois grandes grupos principais (Grupo 1 e 2) com distanciamento total do conteúdo proteico ribossomal (Figura 1A). O grupo 1 foi dividido em dois subgrupos, formado por dois isolados do ES (subgrupo 1.1 e subgrupo 1.2) e um do PR (subgrupo 1.2). Pode ser observado que o conteúdo protéico da AM4 do ES é altamente divergente em relação ao isolado AM2 e AM14 do ES e PR, respectivamente. Os isolados de MG apresentaram uma maior similaridade do conteúdo proteico, com distanciamento menor que 300 para todos os isolados avaliados. Para os isolados de S. agalactiae, também foi observada a formação de dois grandes grupos com distanciamento total (Figura 1B). O grupo 1 compreendeu a maioria dos isolados, sendo composta pelos isolados dos três estados. Neste grupo foram formados dois subgrupos com grande divergência de conteúdo proteico. O subgrupo 1.1 foi constituído por quatro isolados de MG e quatro do PR. O subgrupo 1.2 compreendeu isolados do ES. O grupo 2 foi constituído por quatro isolados representantes dos três estados analisados. 

Para S. uberis a análise espectral mostrou uma grande variabilidade proteica entre os isolados (Figura 1C). Houve também a formação de 2 grupos com total divergência do conteúdo proteico. O grupo 1 foi dividido em dois subgrupos com conteúdo protéico altamente divergentes, sendo constituído pelos isolados AM1 do ES, compondo o subgrupo 1.1 e, pelos isolados AM 10 e AM14 de MG e PR (subgrupo 1.2), respectivamente. O grupo 2 apresentou isolados dos três estados que se distribuíram em diferentes subgrupos com alta variabilidade entre eles. Os isolados AM12 e 15 do PR apresentaram conteúdo proteico mais similar entre si. 

Na literatura, é relatada a alta variabilidade genética dos isolados causadores de mastite associada aos genes de virulência (Gonçalves et al., 2023). Porém, a análise da diversidade do perfil proteico ribossomal de espécies causadoras de mastite bovina também pode destacar a variabilidade dos isolados, como pode ser visto no presente trabalho (figura 1). 

De modo geral, a alta diversidade do conteúdo proteico dos isolados avaliados reflete a alta capacidade adaptativa desses microrganismos em sobreviver às condições impostas no ambiente da fazenda e aumentar as chances de colonização do hospedeiro causando a patogenia. A avaliação microbiológica periódica nas fazendas é importante para o controle de zoonoses, e uma alternativa à utilização de antibióticos é o uso de vacinas autógenas, permitindo a prevenção  de surtos, contribuindo para a sanidade do rebanho e mantendo a produção leiteira dos animais.  

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Referências

• Ruegg, P. L. 2011. Detection, management and prevention of mastites: review 100-year.  J Dairy  Sci. 100: 10381–97. http://doi.org/10.3168 /jds.2017-13023.

• Santos, M. V. and L. F. L Fonseca.  2019. Controle de mastite e qualidade do leite – Desafios e soluções. 1ed. Edição dos autores. 

• Lartigue, M. F, G. Héry-Arnaud, E. Haguenoer, A. S. Domelier, P. O. Schmit, N. van der Mee-Marquet, P. Lanotte, L. Mereghetti, M. Kostrzewa, R. Quentin. 2009. Identification of Streptococcus agalactiae isolates from various phylogenetic lineages by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 47(7):2284-7. doi: 10.1128/JCM.00175-09. 

• Gonçalves, M. S., E. M. S. Dorneles, M. B. Heineman, M. A. V. Paiva e Brito and A. S. Guimarães. 2023. Genetic diversity and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Minas Gerais, Brazil. Cienc. Rural. 53: 1-11. http://doi.org/10.1590/0103-8478cr20210643.

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